Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что:
- * его интенсивность имеет достаточно высокий уровень, что возможно обусловлено гораздо большим соотношением поверхности к единице массы, чем у многоклеточных;
- * процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;
- * субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк -- от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений, включая антропогенные вещества -- загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее самоочищения);
- * бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов -- это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов и широте субстратного спектра.
Ферменты бактерий по локализации делятся на 2 группы:
- * экзоферменты -- ферменты бактерий, выделяемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (протеазы, полисахариды, олигосахаридазы);
- * эндоферменты -- ферменты бактерий, действующие на субстраты внутри клетки (расщепляющие аминокислоты, моносахара, синтетазы).
Синтез ферментов генетически детерминирован, но регуляция их синтеза идет за счет прямой и обратной связи, т. е. для одних -- репрессируется, а для других -- индуцируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде (бета-галактозидаза, бета-лактамаза), называются индуцибельными.
Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными (ферменты гликолиза). Их синтез имеет место всегда, и они всегда содержатся в микробных клетках в определенных концентрациях. Изучают метаболизм бактерий с помощью физико-химических и биохимических методов исследования в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих то или иное соединение в качестве субстрата для трансформации.
Такой подход позволяет судить об обмене веществ путем более, детального изучения процессов различных видов обмена (белков, углеводов) у микроорганизмов.
В большинстве случаев одно и то же вещество используется как в ассимиляции, так и в диссимиляции. Исключением являются углеводы, которые подвергаются расщеплению и не принимают участия в конструктивном обмене.
Метаболизм у микроорганизмов характеризуется интенсивным потреблением питательных веществ. Так, при благоприятных условиях в течение суток одна клетка бактерий усваивает веществ в 30-40 раз больше величины своей массы.
В обмене веществ принимают участие различные химические вещества. В зависимости от этого различают белковый, углеводный, липидный и водносолевой обмен.
Белковый обмен . Распад белка вначале происходит до пептоноз под действием ферментов экзопротеаз. В дальнейшем пептоны под влиянием эндопротеаз расщепляются до аминокислот, которые поступают в клетку. Здесь аминокислоты могут подвергаться дезаминированию и декарбоксилированию.
В результате дезаминирования образуются аммиак, кетокислоты или оксикислоты, спирт и другие вещества.
Декарбоксилирование аминокислот происходит при развитии гнилостных бактерий с образованием токсичных продуктов «трупных ядов». При декарбоксилировании гистидина образуется гистамин, орнитина - путресцин, лизина - кадаверин, тирозина - тирамин. Некоторые микробы вырабатывают фермент триптофаназу, под влиянием которой аминокислота триптофан распадается с образованием индола. Наличие индолообразования используют при идентификации микроорганизмов.
Наряду с реакциями расщепления белков происходят и процессы их синтеза. Для построения белков бактерии используют аминокислоты. Бактериальные клетки удовлетворяют свои потребности в аминокислотах двумя путями: одни микроорганизмы получают аминокислоты при расщеплении белка, другие синтезируют их из простых соединений азота. Важным свойством микробов является способность синтезировать незаменимые аминокислоты (метионин, триптофан, лизин). Синтез белка совершается в рибосомах клетки.
Белковый обмен находится в тесной связи с углеводным обменом. Для построения белковых соединений используется пировиноградная кислота, а дикарбоновые кислоты являются активными посредниками в биосинтезе аминокислот.
Углеводный обмен . Углеводы расщепляются под действием ферментов с образованием глюкозы и мальтозы. Под влиянием ферментов мальтазы, сахаразы, лактазы дисахариды, поступившие внутрь клетки бактерии, подвергаются гидролизу и распаду на моносахариды, которые затем ферментируются с разрывом цепи молекул углевода и освобождением значительного количества энергии.
Расщепление микробами углеводов сопровождается образованием органических кислот, которые могут распадаться до конечных продуктов - ССЬ и Н2О.
Синтез углеводов у микроорганизмов происходит фото- и хе-мосинтетически. При фотосинтезе зеленые и пурпурные бактерии, содержащие пигменты типа хлорофилла, синтезируют глюкозу из диоксида углерода, содержащегося в воздухе. При этом для течения ндотермических реакций синтеза необходима энергия света.
Процесс фотосинтеза у бактерий (прокариот) отличается от фотосинтеза у зеленых растений (эукариоты). У растений при фотолизе донором водорода служит вода, в результате чего выделяется молекулярный кислород.
У прокариот, за исключением синезеленых водорослей, донорами водорода являются H2S, Н2, другие минеральные и органические соединения, поэтому в результате реакции фотосинтеза кислород не образуется. Главным пигментом фотосинтеза у бактерий является бактериохлорофилл, у зеленых растений - хлорофилл, находящийся в хлоропластах, каждый из которых эквивалентен прокариотической клетке. У бактерий хлоропласта отсутствуют.
Хемосинтез осуществляют микроорганизмы, синтезирующие углеводы из глюкозы, которая предварительно образуется в результате сахаролитических реакций, т. е. расщепления сложных Сахаров. Для хемосинтеза используется химическая энергия, освобождаемая при распаде аденозин трифосфорной кислоты (АТФ), т. е. энергия химических реакций.
Липидный обмен включает процессы гидролиза липидов, всасывания жирных кислот и моноглицеридов, биосинтеза специфических липидов, их расщепления и выделения конечных продуктов распада.
Большинство видов бактерий усваивают липиды в виде глицерина, который служит источником энергии. Микроорганизмы используют его также для синтеза липидов, которые в виде включений являются резервными питательными веществами (питательным материалом).
Основные процессы липидного обмена осуществляются при помощи липазы и других липолитических ферментов, прочно связанных с клеточной цитоплазмой.
Водно-солевой обмен включает поступление и выделение воды и минеральных солей, а также превращения, происходящие с ними.
Только небольшое число элементов Периодической системы Д.И. Менделеева требуется микроорганизмам в относительно высоких концентрациях - это десять главных биологических элементов (макроэлементы): С, О, Н, N, S, Р, К, Mg, Са, Fe. Основными компонентами органических соединений являются первые четыре элемента - органогены.
Сера требуется для синтеза аминокислот цистеина и метионина и некоторых ферментов. Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, тейхоевых кислот, многих нуклеотидов. Остальные четыре элемента - это ионы металлов, используемые в качестве кофакторов ферментов, а также компонентов металлокомплексов.
Кроме перечисленных главных элементов микроорганизмам требуются еще десять микроэлементов: Zn, Mn, Na, CI, Mo, Se, Со, Си, W, Ni, которые участвуют в синтезе ферментов, активизируют их.
Из различных элементов и их соединений микроорганизмы синтезируют белки, нуклеопротеиды, глюцидолипиднопротеидные комплексы, нуклеиновые кислоты, ферменты, витамины и др.
Окислительный метаболизм. Бактерии, обладающие окислительным метаболизмом, энергию получают путем дыхания.
Дыхание -
процесс получения энергии в реакциях окисления-восстановления, сопряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донорами электронов могут быть органические (у органотрофов) и неорганические (у литотрофов) соединения, а акцептором - только неорганические соединения.
У бактерий, обладающих окислительным метаболизмом, акцептором электронов (или водорода (Н +)) является молекулярный кислород. В этом случае пируват полностью окисляется в цикле трикарбоновых кислот до С 2 . Цикл трикарбоновых кислот выполняет функции как поставщика предшественников для биосинтетических процессов, так и атомов водорода, который в форме восстановленного НАД переносится на молекулярный кислород через серию переносчиков, обладающих сложной структурно оформленной мультиферментной системой - дыхательной цепью. Дыхательная цепь
у бактерий локализована в ЦПМ и во внутриклеточных мембранных структурах.
Переносчики, осуществляющие транспорт водорода (электронов) на молекулярный кислород, относятся к 4 классам дегидрогеназ, коферментами которых являются НАД, флавопротеины, хиноны и цитохромы. Протоны (электроны) передвигаются от одного носителя к другому в направлении увеличивающегося окислительно-восстановительного потенциала. Типичная цепь выглядит следующим образом:
ЦТК -> НАД(Н 2) -> флавопротеид -> хинон ---> цитохромы: в -> с --> а - O 2
Среди бактериальных цитохромов различают цитохромы в, с, а и а 3 . Конечным этапом переноса электронов (протонов) по дыхательной цепи является восстановление цитохромов а - а3 (цитохромоксидазы). Цитохромоксидаза является конечной оксидазой, передающей электроны на кислород. В процессе переноса электронов по цитохромам меняется валентность входящего в состав железопорфирированной группы железа. Завершается перенос электронов реакцией O 2 + 4F 2+ 2О 2 + 4F 3+ . Образующиеся при окислении ФАД или хинонов протоны связываются ионами О 2 " с образованием воды.
Образование АТФ вдыхательной цепи связывают с хемоосмотическим процессом. Особая ориентация переносчиков в ЦПМ приводит к тому, что передача водорода происходит с внутренней на внешнюю поверхность мембраны, в результате чего создается градиент атомов водорода, проявляющийся в наличии мембранного потенциала. Энергия мембранного потенциала используется для синтеза локализованной в мембране АТФазой АТФ.
В это время у эукариотов ферменты дыхательной цепи имеют относительно постоянный состав, у бактерий встречаются вариации в составе дыхательной цепи. Так, у многих бактерий вместо убихинонов имеются нафтохиноны, состав цитохромов может зависеть от условий роста бактерий. У некоторых бактерий цитохромы отсутствуют, и при контакте с кислородом происходит непосредственный перенос водорода на кислород с помощью флавопротеидов, конечным продуктом при этом оказывается перекись водорода - Н 2 О 2 .
Помимо углеводов прокариоты способны использовать другие органические соединения, в частности белки, в качестве источника энергии, окисляя их полностью до СО 2 и Н 2 О.
Аминокислоты и белки также могут выступать в качестве энергетических ресурсов. Их использование связано, в первую очередь, с определенными ферментативными преобразованиями подготовительного характера. Белки вначале вне клетки расщепляются протеолитическими ферментами на пептиды, которые поглощаются клеткой и расщепляются внутриклеточными пептидазами до аминокислот. Аминокислоты могут использоваться в конструктивном метаболизме, а могут у аммонифицирующих бактерий служить основным материалом в энергетических процессах при окислительном дезаминировании, в результате которого происходит выделение аммиака и превращение аминокислоты в кетокислоту, которая через цикл трикарбоновых кислот вступает в конструктивный метаболизм:
2R-CHNH 2 -СООН + O 2 -> 2R-СО-COOH + 2NH 3
Процесс аммонификации известен как «гниение», при этом происходит накопление продуктов, обладающих неприятным специфическим запахом образующихся при этом первичных аминов.
Гнилостные бактерии осуществляют минерализацию белка, разлагая его до СО 2 , NH 3 , H 2 S. К гнилостным бактериям относятся Proteus, Pseudomonas, Bacillus cereus.
Бродильный (ферментативный) метаболизм.
Ферментация, или брожение, - процесс получения энергии, при котором отщепленный от субстрата водород переносится на органические соединения.
Кислород в процессе брожения участия не принимает. Восстановленные органические соединения выделяются в питательную среду и накапливаются в ней. Ферментироваться могут углеводы, аминокислоты (за исключением ароматических), пурины, пиримидины, многоатомные спирты. Не способны сбраживаться ароматические углеводороды, стероиды, каротиноиды, жирные кислоты. Эти вещества разлагаются и окисляются только в присутствии кислорода, в анаэробных условиях они стабильны. Продуктами брожения являются кислоты, газы, спирты.
При ферментации гексоз (глюкозы) пируват лишь частично окисляется в цикле трикарбоновых кислот. Последний выполняет только функции поставщика предшественников для биосинтетических процессов. Энергия в форме 2 молекул АТФ образуется в результате субстратного фосфорилирования, протекающего при окислении триозофосфата в пируват. Отщепившийся от субстрата водород, находящийся в форме восстановленного НАД, переносится на пируват, превращая его в цепи реакций в этанол, кислоты, газы. Исходя из природы конечных продуктов, различают несколько типов ферментации углеводов.
Спиртовое брожение. Встречается, в основном, у дрожжей. Конечными продуктами являются этанол и СО 2 . Сбраживание глюкозы происходит по ФДФ-пути в анаэробных условиях. При доступе кислорода процесс брожения ослабевает, на смену ему приходит дыхание. Подавление спиртового брожения кислородом называется эффектом Пастера.
Спиртовое брожение используется в пищевой промышленности: хлебопекарной, виноделии.
Молочнокислое брожение. Различают два типа молочнокислого брожения: гомоферментативное и гетероферментативное.
При гомоферментативном типе расщепление глюкозы проходит по ФДФ-пути. Водород от восстановленного НАД передается на пируват при помощи лактатдегидрогеназы, при этом образуется молочная кислота. Гомоферментативное молочнокислое брожение происходит у S. pyogenes, E.faecalis, S. salivarius у некоторых видов рода Lactobacillus: L. dulgaricus, L. lactis.
Гетероферментативное молочнокислое брожение присутствует у бактерий, у которых отсутствуют ферменты ФДФ-пути: альдолаза и триозофосфатизомераза. Расщепление глюкозы происходит по ПФ-пути с образованием фосфоглицеринового альдегида, который превращается далее в пируват по ФДФ-пути ив последующем восстанавливается в лактат. Дополнительными продуктами этого типа брожения являются также этанол, уксусная кислота. Гетероферментативное молочнокислое брожение встречается у различных представителей бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium.
Продукты молочнокислого брожения играют большую роль в формировании колонизационной резистентности бактериями рода Lactobacillus и Bifidobacterium, составляющих облигатную флору кишечника.
Молочнокислые бактерии широко используются в молочной промышленности для получения молочнокислых продуктов, а также в создании пробиотиков.
Муравьинокислое (смешанное) брожение. Встречается у представителей семейств Enterobacteriaceae Vibrionaceae. Глюкоза расщепляется по ФДФ-пути, глюконат расщепляется по КДФГ-пути.
В зависимости от продуктов брожения, выделяющихся в анаэробных условиях, различают два типа процессов:
1. В одном случае происходит расщепление пирувата с образованием ацетилкофермента А и муравьиной кислоты, которая, в свою очередь, может расщепляться на двуокись углерода и молекулярный водород. Другими продуктами брожения, образующимися через цепь реакций, являются этанол, янтарная и молочная кислоты. Сильное кислотообразование можно выявить реакцией с индикатором метил-рот,
который меняет окраску в сильно кислой среде.
2. При другом типе брожения образуется целый ряд кислот, однако главным продуктом брожения являются ацетоин
и 2,3-бутандиол.
Ацетоин образуется из двух молекул пирувата с последующим двукратным декарбоксилированием. При последующем восстановлении ацетоина образуется 2,3-бутандиол. Эти вещества при взаимодействии аl-нафтол в щелочной среде вызывают образование окраски бурого цвета, что выявляется реакцией Фогеса-Проскауэра,
используемой при идентификации бактерий.
Маслянокислое брожение. Масляная кислота, бутанол, ацетон, изопропанол и ряд других органических кислот, в частности уксусная, капроновая, валерьяновая, пальмитиновая, являются продуктами сбраживания углеводов сахароли-тическими строгими анаэробами. Спектр этих кислот, определяемый при помощи газожидкостной хроматографии, используется как экспресс-метод при идентификации анаэробов.
Ферментация белков.
Если для бактерий с бродильным метаболизмом источником энергии служат белки, то такие бактерии называются пептолитическими.
Пептолитическими являются некоторые клостридии, в частности С. histolyticum, С. botulinum.
Пептолитические бактерии гидролизуют белки и сбраживают аминокислоты. Многие аминокислоты сбраживаются совместно с другими, при этом одна выполняет функцию донора, а другая функцию - акцептора водорода. Аминокислота-донор дезаминируется в кетокислоту, которая в результате окислительного декарбоксилирования превращается в жирную кислоту.
5 классификация бактерий по отношению к кислороду. Особенности культивирования анаэробов.
Кислород, широко распространенный в природе, находится в свободном и связанном состоянии. В клетках он находится в связанном состоянии в составе воды и органических соединений. В атмосфере он присутствует в свободном состоянии в виде молекулярной формы, объемная доля которого составляет 21 %.
По отношению к кислороду, а также по использованию его в процессах получения энергии микроорганизмы подразделяются на 3 группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы.
Облигатные аэробы.
Растут и размножаются только в присутствии кислорода. Используют кислород для получения энергии путем кислородного дыхания.
Энергию получают оксидативным метаболизмом, используя кислород как терминальный акцептор электронов в реакции, катализируемой цитохромоксидазой.
Облигатные аэробы подразделяются на строгие аэробы, которые растут при парциальном давлении атмосферы воздуха, и микроаэрофилы, которые, используя кислород в процессах получения энергии, растут при его пониженном парциальном давлении.
Это связано с тем, что у микроаэрофилов имеются ферменты, которые инактивируются при контакте с сильными окислителями и активны только при низких значениях парциального давления кислорода, например, фермент гидрогеназа.
Облигатные анаэробы.
Не используют кислород для получения энергии.
Тип метаболизма у них - бродильный, за исключением метаболизма у двух видов бактерий: Desulfovibrio
и Desulfotomaculum,
которые относятся к хемолитотрофам и обладают сульфатным дыханием. Облигатные анаэробы подразделяются на две группы: строгие анаэробы и аэротолерантные.
Строгие анаэробы характеризуются тем, что молекулярный кислород для них токсичен: он убивает микроорганизмы или ограничивает их рост.
Энергию строгие анаэробы получают маслянокислым брожением. К строгим анаэробам относятся, например, некоторые клостридии (С. botulinum, С, tetani), бактероиды.
Аэротолерантные микроорганизмы не используют кислород для получения энергии, но могут существовать в его атмосфере.
К этой группе относятся молочнокислые бактерии, получающие энергию гетероферментативным молочнокислым брожением.
Методы культивирования анаэробов.
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов.
Физические методы.
Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;
2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;
3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;
4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.
В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.
В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий.
Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта - Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.
Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по способу Виньяль - Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль - Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.
Удаление воздуха производят путем его механического откачивания из специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.
Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.
Химические методы.
Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na 2 S2О 4 .
Биологические методы.
Основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например, часто используют S.aureus или Serratiamarcescens. На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в пространстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 сут). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы.
Основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.
6 ферменты бактерий. Их классификация. Ферментативная активность микробов и ее использование для идентификации бактерий.
В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы.
Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться как внутри клетки - эндоферменты,
так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты.
Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и - в некоторых случаях - для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.
Идентификация бактерий по ферментативной активности.
Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды.
Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Через 3-5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты - индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку.
Для многих микроорганизмов таксономическим признаком служит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов . Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2-6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом».
Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают поплавки или используют полужидкие среды с 0,5% агара.
Для того чтобы определить интенсивное кислотообразование , характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный -при более низких значениях рН.
Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды.
При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса - Проскауэра на ацетоин - промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения.
Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1 % раствором перекиси водорода.
Для определения цитохромоксидазы применяют реактивы: 1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1; 2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2-5 мин.
Для определения нитритов используют реактив Грисса: Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.
7 рост и размножение бактерий. Температурные границы роста. Фазы размножения бактерий на жидких питательных средах.
Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом
- формированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, атакже размножением
- самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции.
Бактерии размножаются
путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.
Делению клеток предшествует
репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается, и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.
Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация.
Размножение бактерий в жидкой питательной среде.
Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура - непрерывной.
При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов
:
1.
лаг-фаза;
2.
фаза логарифмического роста;
3.
фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий;
4.
фаза гибели бактерий.
Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кривой размножения бактерий, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени их культивирования.
Лаг-фаза
- период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов.
Фаза логарифмического (экспоненциального) роста
является периодом интенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5- 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.
Затем наступает фаза стационарного роста
, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.
Завершает процесс роста бактерий фаза гибели
, характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжительность её колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.
Размножение бактерий на плотной питательной среде.
Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.
Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают её. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. И, наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.
Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиотикоподобным действием.
8 принципы культивирования бактерий. Методы выделения чистых культур бактерий, цель.
Универсальным инструментом
Посевы «газоном»
Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты - биовары . Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами , по антигенным свойствам -сероварами , по чувствительности к фагу - фаговарами . Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами , которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.
Колония представляет собой видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам.
Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма.
Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.
Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.
Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.
При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseu-domonas aeruginosa.
Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выявлению соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.
Методы выделения чистых культур бактерий.
Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри - металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.
При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).
Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.
Метаболизм (обмен веществ) микроорганизмов
Питание микробов (конструктивный метаболизм).
Как у всего живого, метаболизм микроорганизмов состоит из двух взаимосвязанных, одновременно протекающих, но противоположных процессов - анаболизма, или конструктивного метаболизма, и катабо-лизма, или энергетического метаболизма.
Обмен веществ у микроорганизмов имеет свои особенности.
1) Быстрота и интенсивность обменных процессов. За сутки мик-робная клетка может переработать такое количество питательных ве-ществ, которое превышает ее собственный вес в 30-40 раз.
2) Выраженная приспособляемость к изменяющимся условиям внешней среды.
3) Питание осуществляется через всю поверхность клетки. Прокариоты не проглатывают питательные вещества, не переваривают их внутри клетки, а расщепляют их вне клетки с помощью экзоферментов до более простых соединений, которые транспортируются в клетку.
Для роста и жизнедеятельности микроорганизмов обязательно на-личие в среде обитания питательных материалов для построения ком-понентов клетки и источники энергии. Для микробов необходимы вода, источники углерода, кислорода, азота, водорода, фосфора, калия, на-трия и других элементов. Требуются также микроэлементы: железо, марганец, цинк, медь для синтеза ферментов. Различные виды микро-бов нуждаются в тех или иных факторах роста, таких, как витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания.
В зависимости от способности усваивать органические или не-органические источники углерода и азота микроорганизмы делятся
на две группы - аутотрофов и гетеротрофов.
Аутотрофы (греч. autos - сам, trophic - питающийся) получают уг-лерод из углекислоты (СО 2) или ее солей. Из простых неорганических соединений они синтезируют белки, жиры, углеводы, ферменты.
Транспорт питательных веществ
Через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки прокариотов проникают только небольшие молекулы, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры вначале расщепляются экзоферементами до более простых соединений, которые транспорти-руются внутрь клетки.
Проникновение питательных веществ в клетку происходит с по-мощью различных механизмов.
Пассивная диффузия - вещества поступают в клетку за счет диф-фузии по градиенту концентрации, то есть вследствие того, что кон-центрация вне клетки выше, чем внутри.
Облегченная диффузия - также совершается по градиенту кон-центрации, но с участием ферментов-переносчиков, так называемых пермеаз. Этот фермент присоединяет к себе молекулы вещества на внеш-ней стороне цитоплазматической мембраны и отдает его на внутрен-ней стороне в неизмененном виде. Затем свободный переносчик пере-мещается снова к наружной стороне мембраны, где связывает новые молекулы вещества. При этом каждая пермеаза переносит какое-то определенное вещество.
Эти два механизма переноса не требуют энергетических затрат.
Активный перенос происходит также с участием пермеаз, причем осуществляется против градиента концентрации. Микробная клетка может накопить вещество в концентрации, в тысячи раз превышаю-щих ее во внешней среде. Такой процесс требует затрат энергии, то есть расходуется АТФ.
Транслокация радикалов - это четвертый механизм передачи ве-ществ. Это активный перенос химически измененных молекул, с учас-тием пермеаз. Например, такое простое вещество, как глюкоза, пере-носится в фосфорилированном виде.
Выход веществ из бактериальной клетки происходит путем пас-сивной диффузии или путем облегченной диффузии с участием пермеаз.
Ферменты
Ферменты - катализаторы биологических процессов. Характер-ным свойством ферментов является их специфичность. Каждый фер-мент участвует только в определенной реакции с определенным хи-мическим соединением.
Ферменты, которые выделяются бактериальной клеткой в окру-жающую среду и осуществляют внеклеточное переваривание, называ-ются экзоферментами. К экзоферментам относится также беталактамаза, которая разрушает пенициллин и другие бета-лактамные анти-биотики, защищая бактерии от их действия.
Эндоферменты участвуют в процессах метаболизма внутри клетки.
Для бактерий, в силу их малых размеров, характерна высокая сте-пень саморегуляции продукции ферментов. В этом отношении фермен-ты можно разделить на конститутивные и адаптивные. Конститутив-ные ферменты продуцируются клеткой постоянно. Адаптивные фер-менты, в свою очередь, подразделяются на индуцируемые и ингибируемые. Продукция индуцируемых ферментов происходит в присутствии субстрата. Например, ферменты, расщепляющие лактозу, образуются в клетке в только присутствии этого углевода. Продукция ингибируемых ферментов, напротив, подавляется присутствием в среде конеч-ного субстрата в достаточно большой концентрации (например, трип-тофана).
Многие патогенные бактерии, кроме ферментов обмена, выделя-ют ферменты, являющиеся факторами вирулентности. Например, та-кие ферменты, как гиалуронидаза, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза, нейраминидаза способствуют проникновению и распространению патогенного микроба в организме.
Способность бактерий продуцировать определенные ферменты -признак настолько постоянный, что его используют для идентифика-ции, то есть определения вида бактерий. Определяют сахаролитические свойства (ферментацию углеводов) и протеолитические свойства (фер-ментацию белков и пептона).
Для микробов характерна высокая ферментативная активность. Это используется в промышленности. В медицине находят применение такие лечебные средства, как стрептокиназа (фибринолизин стреп-тококков), террилитин (протеаза Aspergillus terricola). Ферменты мик-робного происхождения - липазы и протеазы, входящие в состав мою-щих средств и стиральных порошков, расщепляют белковые и жировые загрязнения до воднорастворимых веществ, которые легко смываются водой.
Биологическое окисление (энергетический метаболизм)
Процесс биологического окисления дает энергию, необходимую для жизни клетки. Сущность процесса заключается в последователь-ном окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ.
Окислению подвергаются углеводы, спирты, органические кис-лоты, жиры и другие вещества. Но для большинства микроорганизмов источником энергии служат гексозы, в частности, глюкоза.
У микроорганизмов существует два типа биологического окис-ления: аэробный и анаэробный. При аэробном типе участвует кисло-род, и этот процесс называется дыханием в строгом смысле слова. При анаэробном типе биологического окисления освобождение энергии из органических молекул происходит без участия кислорода и называет-ся брожением.
Начальный этап анаэробного расщепления глюкозы с образова-нием пировиноградной кислоты (ПВК) происходит одинаково. Эта
кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и многих видов брожений.
При аэробном типе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот. Водород ПВК поступает в дыхательную цепь. Это цепь окислительных ферментов (цитохромы и цитохромоксидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоединяется к активированному под действием цитохромоксидазы кислороду с об-разованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углекислота) и вода. В процессе дыхания на одну молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ.
При анаэробном типе биологического окисления энергия образу-ется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превра-щается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продуктом молочнокислого брожения является молочная кислота, маслянокислого брожения - масляная кислота. При процессах брожения на одну моле-кулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.
Микробную природу брожений впервые открыл и доказал Пастер. Изучая маслянокислое брожение, Пастер впервые столкнулся с возможностью жизни без кислорода, то есть с анаэробиозом. Он так-же установил явление, которое впоследствии было названо "эффектом Пастера": прекращение процесса брожения при широком доступе кис-лорода.
Анаэробиоз существует только среди прокариотов. Все микро-организмы по типу дыхания делятся на следующие группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы.
Облигатные аэробы размножаются только при наличии свободно-го кислорода. К ним можно отнести микобактерии туберкулеза, хо-лерный вибрион, чудесную палочку. ,
Облигатные или строгие анаэробы получают энергию при от-сутствии доступа кислорода. Они имеют неполный набор окислитель-но-восстановительных ферментов, у них нет цитохромной системы, поэтому у них не происходит полного окисления субстрата (глюкозы) до конечных продуктов - СО 2 и Н 2 О. Более того, в присутствии свобод-ного кислорода образуются токсические соединения: перекись водо-рода Н 2 О 2 и свободный перекисный радикал кислорода О 2 . Аэробы при этом не погибают, так как продуцируют ферменты, разрушающие эти токсические соединения (супероксиддисмутазу и каталазу). Спорообразующие анаэробы в этих условиях прекращают размножение и превращаются в споры. Неспорообразующие анаэробы погибают даже при кратковременном контакте с кислородом.
К облигатным спорообразующим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, анаэробной раневой инфекции; к неспорообразующим анаэробам - бактероиды, пептобактерии, бифидумбактерии.
Большинство патогенных бактерий - факультативные (условные) анаэробы, например, энтеробактерии. Они имеют полный набор фер-ментов и при широком доступе кислорода окисляют глюкозу до ко-нечных продуктов; при низком содержании кислорода они вызывают брожение.
Микроаэрофилы размножаются в присутствии небольших коли-честв кислорода. Например, кампилобактеры могут размножаться при 3-6% кислорода.
Рост и размножение микроорганизмов
Термином "рост" обозначают увеличение размеров отдельной осо-би, а "размножение" - увеличение числа особей в популяции.
Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. У грамположительных бактерий из клеточной стен-ки и цитоплазматической мембраны образуется перегородка, враста-ющая внутрь. У грамотрицательных бактерий образуется перетяжка, и затем происходит разделение клетки на две особи.
Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромо-сомы по полуконсервативному типу. При этом двуспиральная цепь ДНК раскручивается, каждая нить достраивается комплиментарной нитью и в результате каждая дочерняя клетка получает одну мате-ринскую нить и одну вновь образованную.
Быстрота размножения разных видов бактерий различна. Боль-шинство бактерий делятся каждые 15-30 минут. Микобактерии тубер-кулеза делятся медленно - одно деление за 18 часов, спирохеты - одно деление за 10 часов.
Если посеять бактерии в жидкую питательную среду определен-ного объема и затем каждый час брать пробу и определять количество живых бактерий в такой замкнутой среде и составить график, на кото-ром по оси абсцисс откладывать время в часах, а по оси ординат лога-рифм количества живых бактерий, то получим кривую роста бактерий. Рост бактерий подразделяют на несколько фаз (рис. 5):
1) латентная фаза (лаг-фаза) - бактерии адаптируются к пита-тельной среде, количество их не увеличивается;
2) фаза логарифмического ро-ста - количество бактерий увели-чивается в геометрической про-грессии;
3) фаза стационарного роста, во время которой число вновь об-разованных бактерий уравнивает-ся числом погибших, и количество живых бактерий остается постоян-ным, достигая максимального уровня. Это М-концентрация - величина, характерная для каждого вида бактерий;
4) фаза отмирания, когда число отмирающих клеток начинает пре-обладать над числом жизнеспособных бактерий вследствие накопления продуктов метаболизма и истощения среды.
Культура бактерий в такой замкнутой несменяющейся среде на-зывается периодической. Если же в засеянный объем непрерывно подают свежую питательную среду и удаляют такое же количество жидкости, то такую культуру называют непрерывной. Количество живых бактерий в такой культуре будет постоянно в М-концентрации. Непрерывное куль-тивирование применяют в микробиологической промышленности.
Образование микробами пигментов, ароматических веществ. Светящиеся микроорганизмы
Некоторые виды микробов вырабатывают красящие вещества -пигменты. Если пигмент растворим в воде, то окрашенными предс-тавляются и колонии микробов, и питательная среда. Например, си-ний пигмент, выделяемый синегнойной палочкой (Pseudomonas aeruginosa), окрашивает среду в синий цвет. Пигменты, растворимые в орга-нических растворителях, но нерастворимые в воде, не окрашивают питательную среду. Такой пигмент красного цвета, так называемый продигиозан, растворимый в спирте, выделяет чудесная палочка (Serratia marcescens). К этой же группе относятся пигменты желтого, оранжевого, красного цвета, характерные для кокковой воздушной микрофлоры. У некоторых видов микробов пигменты настолько проч-но связаны с протоплазмой клетки, что не растворяются ни в воде, ни в органических растворителях. Среди патогенных бактерий такие пиг-менты золотистого, палевого, лимонно-желтого цвета образуют ста-филококки.
Цвет пигмента используется для определения вида бактерий.
Некоторые микроорганизмы в процессе метаболизма вырабатыва-ют ароматические вещества. Например, для синегнойной палочки ха-рактерен запах жасмина. Характерный запах сыров, сливочного мас-ла, особый "букет" вина объясняется жизнедеятельностью микробов, которые используются для производства этих продуктов.
Свечение (люминесценция) микробов происходит в результате ос-вобождения энергии при биологическом окислении субстрата. Свечение бывает тем интенсивнее, чем сильнее приток кислорода Светящиеся бактерии были названы фотобактериями. Они придают свечение че-шуе рыб в море, грибам, гниющим деревьям, пищевым продуктам, на поверхности которых размножаются. Свечение может наблюдаться при низких температурах, например, в холодильнике. Патогенных для че-ловека среди фотогенных бактерий не установлено.
Свечение пищевых продуктов, вызванное бактериями, не приво-дит к их порче, и даже может свидетельствовать о том. что в этих про-дуктах не происходит гниения, поскольку оно прекращается при разви-тии гнилостных микроорганизмов.
ГЛАВА 5.
МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И БИОХИМИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ
Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в ла-боратории, применяется для изучения их свойств и для получения био-массы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые про-стейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в орга-низме животного или в живых клетках.
Культуральные свойства данного вида микроорганизмов - это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на пита-тельных средах. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микро-организмов.
Питательные среды
Питательные среды должны соответствовать определенным тре-бованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необхо-димые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные мик-роорганизмы растут на простых питательных средах, другие для свое-го размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, ви-таминов.
В питательных средах должны быть созданы определенные условия путем добавления хлорида натрия или буферных растворов. Для боль-шинства бактерий благоприятной является питательная среда, со-держащая 0,5% хлорида натрия. Реакция питательной среды, благоп-риятная для большей части патогенных бактерий - слабощелочная, что соответствует рН=7,2-7,4. Холерный вибрион растет при рН=7,8-8,5, гри-бы - при рН=5-5,5. Питательные среды должны быть влажными, то есть содержать достаточное количество воды, быть по возможности прозрач-ными и стерильными, то есть до посева не содержать микробов.
По составу и происхождению питательные среды бывают естест-венные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды - это натуральный продукт, например, картофель, другие ово-щи. Искусственные питательные среды готовят по определенной про-писи из продуктов с добавлением органических и неорганических со-единений. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях.
По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужид-кие, плотные. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар -полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар-агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100°С и застывающий при 45°С.
Для получения плотной питательной среды агар-агар добавляют в кон-центрации 1,5-2%, для полужидкой - 0,5%.
По целевому назначению питательные среды могут быть разде-лены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференци-ально-диагностические.
Обычные (простые) питательные среды применяют для культиви-рования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).
Специальные питательные среды применяют для культивирования микроорганизмов, которые не растут на простых средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка.
Элективные питательные среды используют для выделения одного какого-либо вида из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растет на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; рост других бактерий задерживается на этой среде. Например, свернутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочки брюшного тифа, солевые среды для стафилококка.
Дифференциально-диагностические питательные среды применя-ются для отличия одних видов бактерий от других по их фермента-тивной активности (см. соответствующий раздел).
Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий
Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.
Температура должна быть оптимальной для данного вида. Боль-шинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, ес-тественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.
Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроор-ганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэ-робность среды.
Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохими-ческие и другие свойства микробов, необходимо получить чистую куль-туру. Обычно культурой микробов называют скопление их на пи-тательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) рос-та или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чи-стая культура - это культура микробов одного вида, полученная из од-ной колонии. В лабораториях для различных исследований применя-ют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в опре-деленное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения актив-ности пенициллина.
Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:
1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, ок-рашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего пита-тельного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют остав-шуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на тре-тьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наи-меньшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изоли-рованные колонии.
Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на од-ной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из пер-вого сектора во второй и таким же образом последовательно в тре-тий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после су-точного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.
2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непроз-рачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отби-рают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным пита-тельным агаром.
3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бак-терий выделение чистой культуры можно считать законченным.
Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных пита-тельных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные коло-нии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кру-жевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми края-ми, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».
ДокументВ качестве первого частой Глава ... сельскохозяйственной микробиологии (С.–Петербург) и чешскими микробиологами Общая
Глава 4 прорывные технологии в системах жизнеобеспечения содержание главы 4 1 жизнеобеспечение человека
ЛитератураВ качестве первого примера рассмотрим систему... частой причиной желудочных расстройств. Глава ... сельскохозяйственной микробиологии (С.–Петербург) и чешскими микробиологами . ... М: Энергоатомиздат, 1992 Ацюковский В.А. Общая эфиродинамика. - М: Энергоатомиздат, ...
Наши книги отличают тщательность редакционной подготовки высокое качество полиграфического исполнения и доступность читателю
УчебникиВузов. Учебник состоит из семи частей . Часть первая - «Общая микробиология» - содержит сведения о морфологии и физиологии бактерий... здравоохранения Российской Федерации в 1997 году. В первой главе содержится пропедевтический курс и диететика; во...
Аннотация
Введение
1. Общие понятия об обмене веществ и энергии
2. Конструктивный метаболизм
3. Потребность прокариот в питательных веществах
3.1 Источники углерода
3.3 Потребности в источниках серы и фосфора
3.4 Необходимость ионов металлов
3.5 Потребность в факторах роста
4. Типы метаболизма микроорганизмов
5. Энергетический метаболизм фототрофов
6. Энергетический метаболизм хемотрофов, использующих процессы брожения
7. Энергетический метаболизм хемоорганотрофов, использующих процесс дыхания
8. Энергетический метаболизм хемолитоавтотрофов
Заключение
Данная курсовая работа содержит основные сведенья о конструктивном и энергетическом метаболизме бактерий. Работа выполнена на 37 листах. Содержит 5 рисунков и 1 таблицу.
Совокупность процессов превращения материи в живом организме, сопровождающихся постоянным ее обновлением, называется обменном веществ или метаболизмом.
Важнейшими свойствами живых организмов являются способность, к самовоспроизведению и теснейшая взаимосвязь их с окружающей средой. Любой организм может существовать только при условии постоянного притока питательных веществ из внешней среды и выделения в нее продуктов жизнедеятельности.
Питательные вещества, поглощаемые клеткой, в результате сложных биохимических реакций превращаются в специфические клеточные компоненты. Совокупность биохимических процессов поглощения, усвоения питательных веществ и создания за их счет структурных элементов клетки называется конструктивным обменом или анаболизмом. Конструктивные процессы идут с поглощением энергии. Энергию, необходимую для процессов биосинтеза других клеточных функций, таких, как движение, осморегуляция и т. д., клетка получает за счет потока окислительных реакций, совокупность которых представляет собой энергетический обмен, или катаболизм (рис. 1).
Все живые организмы могут использовать только химически связанную энергию. Каждое вещество обладает определенным запасом потенциальной энергии. Главные материальные носители ее химические связи, разрыв или преобразование которых приводит к освобождению энергии.
Энергетический уровень химических связей неодинаков. Для одних он имеет величину порядка 8-10 кДж. Такие связи называют нормальными. В других связях заключена значительно большая энергия - 25-40 кДж. Это так называемые макроэргические связи. Почти все известные соединения, обладающие такими связями, включают атомы фосфора и серы, участвующие в образовании этих связей.
Важнейшую роль в жизнедеятельности клетки играет аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). В состав ее молекулы входят аденин, рибоза и три остатка фосфорной кислоты: (Приложения Рис 2)
АТФ занимает центральное место в энергетическом обмене клетки. Макроэргические связи в молекуле АТФ очень непрочны. Гидролиз этих связей приводит к освобождению значительного количества свободной энергии:
АТФ + Н20→АДФ + Н3Р04- 30,56 кДж
Гидролиз протекает с участием специфических ферментов, обеспечивая энергией биохимические процессы, идущие с поглощением энергии. В этом случае АТФ играет роль поставщика энергии. Имея малый размер, молекула АТФ и диффундирует в различные участки клетки. Запас АТФ в клетках непрерывно возобновляется за счет реакций присоединения остатка фосфорной кислоты к молекуле аденозиндифосфорной кислоты (АДФ):
АДФ + Н3Р04 → АТФ + Н20
Синтез АТФ, как и гидролиз, идет при участии ферментов но сопровождается поглощением энергии, способы получения которой у микроорганизмов хотя и разнообразны, но могут быть сведены к двум типам:
1) использование энергии света;
2) использование энергии химических реакций.
При этом тот и другой виды энергии трансформируются в энергию химических связей АТФ. Таким образом, АТФ выполняет в клетке роль трансформатора.
Анаболизм и катаболизм неразрывно связаны, составляя единое целое, поскольку продукты энергетического обмена (АТФ и некоторые низкомолекулярные соединения) непосредственно используются в конструктивном обмене клетки (рис. 6.1).
В клетках микроорганизмов соотношение между энергетическими и конструктивными процессами зависит от ряда конкретных условий, в частности от характера питательных веществ. Тем не менее по объему катаболические реакции обычно превосходят биосинтетические процессы. Взаимосвязь и сопряженность этих двух видов метаболизма проявляется прежде всего в том, что суммарный объем конструктивных процессов полностью зависит от количества доступной энергии, получаемой в ходе энергетического обмена.
Конструктивный метаболизм направлен на синтез четырех основных типов биополимеров: белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов.
Ниже показана обобщенная условная схема биосинтеза сложных органических соединений, где выделены следующие основные этапы: образование из простейших неорганических веществ органических предшественников (I), из которых на следующем этапе синтезируются «строительные блоки» (II). В дальнейшем строительные блоки, связываясь друг с другом ковалентными связями, образуют биополимеры (III): Приложения (рис. № 3)
Представленная схема биосинтетических процессов не отражает всей сложности превращения низкомолекулярных предшественников в строительные блоки с большой молекулярной массой. На самом деле синтез протекает как серия последовательных реакций с образованием разнообразных промежуточных продуктов метаболизма. Кроме того, уровни развития биосинтетических способностей микроорганизмов очень различны. У одних микробов конструктивный метаболизм включает все показанные на схеме этапы, у других ограничен вторым и третьим или только третьим этапом. Именно поэтому микроорганизмы резко отличаются друг от друга по своим пищевым потребностям. Однако элементный состав пищи одинаков для всех живых организмов и должен включать все компоненты, входящие в клеточное вещество: углерод, азот, водород, кислород и др.
В зависимости от используемых в конструктивном обмене источников углерода микроорганизмы делятся на две группы: автотрофы и гетеротрофы.
Автотрофы (от греч. «autos» - сам, «trophe» - пища) в качестве единственного источника углерода используют диоксид углерода и из этого простого неорганического соединения-предшественника синтезируют все необходимые биополимеры. Способность к биосинтезу у автотрофов самая высокая.
Гетеротрофы (от греч. «heteros» - другой) нуждаются в органических источниках углерода. Их пищевые потребности чрезвычайно разнообразны. Одни из них питаются продуктами жизнедеятельности других организмов или используют отмершие растительные и животные ткани. Такие микроорганизмы называются сапрофитами (от греч. «sapros» - гнилой и «phyton» - растение). Число органических соединений, используемых ими в качестве источников углерода, чрезвычайно велико - это углеводы, спирты, органические кислоты, аминокислоты и т. д. Практически любое природное соединение может быть использовано тем или иным видом микроорганизмов в качестве источника питания или энергии.
Для синтеза клеточных белков микроорганизмам необходим азот. По отношению к источникам азотного питания среди микроорганизмов можно выделить автоаминотрофов и гетероаминотрофов. Первые способны использовать азот неорганический (аммонийный, нитратный, молекулярный) или простейшие формы органического (мочевина) и из этих соединений строить разнообразные белки своего тела. При этом все формы азота сначала переводятся в аммонийную форму. Эта наиболее восстановленная форма азота легко трансформируется в аминогруппу. Гетероаминотрофы нуждаются в органических формах азота - белках и аминокислотах. Некоторым из них требуется полный набор аминокислот, другие создают необходимые белковые соединения из одной - двух аминокислот путем их преобразования.
Многие гетеротрофные по отношению к углероду микроорганизмы являются автоаминотрофами. К ним относятся я бактерии, участвующие в очистке сточных вод.
Потребность в кислороде и водороде для конструктивного обмена микроорганизмы удовлетворяют за счет воды и органических питательных веществ. Источниками зольных элементов (P, S, K, Mg, Fe) служат соответствующие минеральные соли. Потребность в этих элементах невелика, но присутствие в среде обязательно. Помимо того, для нормальной жизнедеятельности микробов необходимы микроэлементы – Zn, Co, Cu, Ni и др. Часть их входит в состав естественного питания микробов, часть усваивается ими из минеральных солей.
Способы получения пищи, т. е. способы питания микроорганизмов, отличаются большим разнообразием. Различают три основных способа питания: голофитное, сапрозойное, голозойное.
Голофитное питание (от греч. «голо» - целиком, «фит» - растение) совершается по типу фотосинтеза растений. Такое питание присуще только автотрофам. Среди микроорганизмов этот способ свойствен водорослям, окрашенным формам жгутиковых и некоторым бактериям.
3. Метаболизм бактерий
Метаболизм (обмен веществ) бактерий представляет собой совокупность двух взаимосвязанных противоположных процессов катаболизма и анаболизма .
Катаболизм (диссимиляция) – распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ.
Анаболизм (ассимиляция) – синтез веществ с затратой энергии.
Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что :
Его интенсивность имеет достаточно высокий уровень , что возможно обусловлено гораздо большим соотношением поверхности к единице массы, чем у многоклеточных;
Процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;
субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк – от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений, включая антропогенные вещества – загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее самоочищения);
Бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов – это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов и широте субстратного спектра.
Ферменты бактерий по локализации делятся на 2 группы :
экзоферменты – ферменты бактерий, выделяемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (например, протеазы, полисахариды, олигосахаридазы);
эндоферменты – ферменты бактерий, действующие на субстраты внутри клетки (например, ферменты, расщепляющие аминокислоты, моносахара, синтетазы).
Синтез ферментов генетически детерминирован, но регуляция их синтеза идет за счет прямой и обратной связи , т. е. для одних – репрессируется, а для других – индуцируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде (например, бета-галактозидаза, бета-лактамаза), называются индуцибельными .
Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными (например, ферменты гликолиза). Их синтез имеет место всегда, и они всегда содержатся в микробных клетках в определенных концентрациях.
Изучают метаболизм бактерий с помощью физико-химических и биохимических методов исследования в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих то или иное соединение в качестве субстрата для трансформации. Такой подход позволяет судить об обмене веществ путем более детального изучения процессов различных видов обмена (белков, углеводов) у микроорганизмов.
Вопрос 5. Особенности белкового и углеводного обмена у бактерий
1. Белковый обмен
Белковый обмен у бактерий – это, с одной стороны, – процесс синтеза собственных аминокислот и белков путем ассимиляции необходимых компонентов из внешней среды, а с другой, – внеклеточное расщепление белков под воздействием различных ферментов. Если расщепление белков происходит в анаэробных условиях , то этот процесс называется гниение , а если он идет в аэробных условиях – тление.
При наличии у бактерий протеаз белки расщепляются ими до промежуточных продуктов распада – пептонов, а при наличии у бактерий пептидаз пептоны расщепляются ими до аминокислот и продуктов их распада (аммиака, сероводорода, индола). Протеолитические (способность расщеплять белки) и пептолитические (способность расщеплять пептоны) свойства выражены далеко не у всех бактерий, поэтому их изучение в совокупности с другими ферментативными свойствами помогает идентифицировать бактерии.
2. Углеводный обмен
Углеводный обмен у бактерий также носит двоякий характер – это процесс синтеза и распада углеводов . Расщепление углеводов бактериями (сахаролитические свойства) в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды называется горением , а расщепление ими углеводов в анаэробных условиях – брожением .
В зависимости от характера конечных продуктов разложения углеводов в анаэробных условиях различают брожение:
Спиртовое,
Молочнокислое,
Пропионовокислое,
Муравьинокислое,
Маслянокислое,
Уксуснокислое.
Молекулярный кислород в процессах брожения не участвует. Большинство бактерий, осуществляющих брожение – облигатные анаэробы . Однако некоторые из них – факультативные анаэробы , способны осуществлять процесс брожения в присутствии кислорода, но без его участия. Более того, этот кислород подавляет процесс брожения. И оно сменяется горением (дыханием – конечный акцептор водорода – кислород). Этот эффект был назван эффектом Пастера и является одним из классических примеров смены метаболизма у бактерий в зависимости от условий среды .
3. Типы биологического окисления у бактерий
Синтез биополимеров бактериальной клетки требует энергии. Она образуется в ходе биологического окисления и запасается в виде молекул макроэргов – АТФ и АДФ.
Органеллами дыхания у большинства бактерий являются производные цитоплазматической мембраны – мезосомы , на которых локализуются специальные дыхательные ферменты типа цитохромоксидаз. Тип биологического окисления является одним из ключевых признаков, позволяющих дифференцировать различные микроорганизмы. По этому признаку выделяют три группы бактерий :
Первая группа – облигатные аэробы , которые способны получать энергию только путем дыхания и нуждаются в молекулярном кислороде как конечном акцепторе электронов. Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерно окисление, при котором конечным акцептором электронов является кислород.
Вторая группа – облигатные анаэробы – бактерии, способные расти только в среде, лишенной кислорода . Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерна ферментация, при которой происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору.
Третья группа – факультативные анаэробы – бактерии, способные расти как в присутствии, так и в отсутствии кислорода , и использовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения.
Среди них могут быть факультативно-анаэробные бактерии , способные переключаться с окисления на ферментацию (энтеробактерии), а также аэротолерантные факультативно-анаэробные бактерии , которые могут расти в присутствии атмосферного кислорода, но не используют его, а получают энергию исключительно с помощью брожения (например, молочнокислые бактерии).
Вопрос 6. Рост и размножение. Генетика бактерий
1. Рост и размножение бактерий
Для микробиологической диагностики, изучения микроорганизмов и в биотехнологических целях микроорганизмы культивируют на искусственных питательных средах.
Под ростом бактерий понимают увеличение массы клеток без изменения их числа в популяции как результат скоординированного воспроизведения всех клеточных компонентов и структур.
Увеличение числа клеток в популяции микроорганизмов обозначают термином «размножение» . Оно характеризуется временем генерации (интервал времени, за который число клеток удваивается) и таким понятием, как концентрация бактерий (число клеток в 1 мл).
В отличии от митотического цикла деления у эукариотов, размножение большинства прокариотов (бактерий) идет путем бинарного деления , а актиномицетов – почкованием . При этом все прокариоты существуют в гаплоидном состоянии, поскольку молекула ДНК представлена в клетке в единственном числе.
2. Бактериальная популяция. Колония
При изучении процесса размножения бактерий необходимо учитывать, что бактерии всегда существуют в виде более или менее многочисленных популяций , и развитие бактериальной популяции в жидкой питательной среде в периодической культуре можно рассматривать как замкнутую систему. В этом процессе выделяют 4 фазы :
1-я – начальная, или лаг-фаза , или фаза задержки размножения, она характеризуется началом интенсивного роста клеток , но скорость их деления остается невысокой;
2-я – логарифмическая, или лог-фаза , или экспоненциальная фаза, она характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции;
3-я – стационарная фаза , она наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образующихся и гибнущих клеток . Число живых бактериальных клеток в популяции на единицу объема питательной среды в стационарной фазе обозначается как М-концентрация . Этот показатель является характерным признаком для каждого вида бактерий;
4-я – фаза отмирания (логарифмической гибели), которая характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.
Прекращение роста численности (размножения) популяции микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и/или накоплением в ней продуктов метаболизма микробных клеток. Поэтому, удаляя продукты метаболизма и/или заменяя питательную среду, регулируя переход микробной популяции из стационарной фазы в фазу отмирания, можно создать открытую биологическую систему, стремящуюся к устранению динамического равновесия на определенном уровне развития популяции. Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием (непрерывная культура). Рост в непрерывной культуре позволяет получать большие массы бактерий при проточном культивировании в специальных устройствах (хемостатах и турбидистатах) и используется при производстве вакцин, а также в биотехнологии для получения различных биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами.
Для изучения метаболических процессов на протяжении цикла клеточного деления возможно также использование синхронных культур. Синхронные культуры – культуры бактерий, все члены популяции которых находятся в одной фазе цикла. Это достигается с помощью специальных методов культивирования, однако через несколько одновременных делений синхронизированная клеточная суспензия постепенно снова переходит к асинхронному делению, так что число клеток увеличивается в дальнейшем уже не ступенчато, а непрерывно.
При культивировании на плотных питательных средах бактерии образуют колонии . Это – видимое невооруженным глазом скопление бактерий одного вида, являющееся чаще всего потомством одной клетки. Колонии бактерий разных видов отличаются :
Величиной,
Прозрачностью,
Высотой,
Характером поверхности,
Консистенцией.
Характер колоний – один из таксономических признаков бактерий.
3. Генетика бактерий
Важнейшим признаком живых организмов являются изменчивость и наследственность . Основу наследственного аппарата бактерий, как и всех других организмов, составляет ДНК (у РНК-содержащих вирусов – РНК ).
Наряду с этим наследственный аппарат бактерий и возможности его изучения имеют ряд особенностей. Прежде всего, бактерии – гаплоидные организмы , т. е. они имеют одну хромосому . В связи с этим при наследовании признаков отсутствует явление доминантности . Бактерии обладают высокой скоростью размножения, в связи с чем за короткий промежуток времени (сутки) сменяется несколько десятков поколений бактерий. Это дает возможность изучать огромные по численности популяции и достаточно легко выявлять даже редкие по частоте мутации.
Наследственный аппарат бактерий представлен хромосомой . У бактерий она одна. Если и встречаются клетки с двумя, четырьмя хромосомами, то они одинаковые. Хромосома бактерий – это молекула ДНК . Длина этой молекулы достигает 1,0 мм и, чтобы «уместиться» в бактериальной клетке, она не линейная, как у эукариотов, а суперспирализована в петли и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране.
На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены . У кишечной палочки, например, их более 2 тысяч. Однако генотип (геном ) бактерий представлен не только хромосомными генами. Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов являются IS-последовательности, транспозоны и плазмиды .
Вопрос 7. Функциональные единицы генома. Изменчивость бактериальной клетки
1. Функциональные единицы генома
IS-последовательности – короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих тот или иной белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность IS-последовательностей перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки). IS-последовательности одинаковы у разных бактерий.
Транспозоны . Это молекулы ДНК – более крупные, чем IS-последовательности. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген , кодирующий тот или иной признак. Транспозоны легко перемещаются по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии как их собственных структурных генов, так и соседних хромосомных. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы, автономно, но не способны к автономной репликации.
Плазмиды - это кольцевые суперспиралевидные молекулы ДНК . Их молекулярная масса колеблется в широких пределах и может быть в сотни раз больше, чем у транспозонов. Плазмиды содержат структурные гены , наделяющие бактериальную клетку разными, весьма важными для нее свойствами :
R-плазмиды – лекарственной устойчивостью,
Col-плазмиды – синтезировать колицины,
F-плазмиды – передавать генетическую информацию,
Hly-плазмида – синтезировать гемолизин,
Tox-плазмида – синтезировать токсин,
Плазмиды биодеградации – разрушать тот или иной субстрат и другие.
Плазмиды могут быть интегрированы в хромосому (в отличие от IS-последовательностей и транспозонов, встраиваются в строго определенные участки ), а могут существовать автономно . В этом случае они обладают способностью к автономной репликации, и именно поэтому в клетке может быть 2, 4, 8 копий такой плазмиды.
Многие плазмиды имеют в своем составе гены трансмиссивности и способны передаваться от одной клетки к другой при конъюгации (обмене генетической информацией). Такие плазмиды называются трансмиссивными.
2. Фактор фертильности
Наличие F-плазмиды (фактор фертильности, половой фактор ) придает бактериям функции донора, и такие клетки способны передавать свою генетическую информацию другим, F-клеткам . Таким образом, наличие F-плазмиды является генетическим выражением пола у бактерий . С F-плазмидой связана не только донорская функция, но и некоторые другие фенотипические признаки. Это, в первую очередь, наличие F-пилей (половых ресничек ), с помощью которых и устанавливается контакт между донорскими и реципиентными клетками. Через их канал и передается донорская ДНК при рекомбинации. На половых ресничках расположены рецепторы для мужских fi-фагов. F-клетки не имеют таких рецепторов и не чувствительны к таким фагам.
Таким образом, наличие F-ресничек и чувствительность к fi-фагам можно рассматривать как фенотипическое выражение (проявление) пола у бактерий.
3. Изменчивость
У бактерий различают два вида изменчивости – фенотипическую и генотипическую .
Фенотипическая изменчивость – модификации – не затрагивает генотип . Модификации затрагивают большинство особей популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу через большее (длительные модификации) или меньшее (кратковременные модификации) число поколений.
Генотипическая изменчивость затрагивает генотип . В ее основе лежат мутации и рекомбинации.
Мутации бактерий принципиально не отличаются от мутаций эукариотических клеток. Особенностями мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления , так как имеется возможность работать с большими по численности популяциями бактерий. По происхождению мутации могут быть :
спонтанными,
индуцированными .
По протяженности :
Точечные,
Хромосомные мутации.
По направленности :
Обратные мутации.
Рекомбинации у бактерий отличаются от рекомбинаций у эукариот :
Во-первых, у бактерий имеется несколько механизмов рекомбинаций (обмена генетическим материалом).
Во-вторых, при рекомбинациях у бактерий образуется не зигота, как у эукариот, а мерозигота (несет полностью генетическую информацию реципиента и часть генетической информации донора в виде дополнения).
В третьих, при рекомбинациях у бактериальной клетки-рекомбината изменяется не только качество, но и количество генетической информации .
Трансформация введения в бактериальную клетку-реципиент готового препарата ДНК (специально приготовленного или непосредственно выделенного из клетки-донора). Чаще всего передача генетической информации происходит при культивировании реципиента на питательной среде, содержащей ДНК донора.
Для восприятия донорской ДНК при трансформации клетка-реципиент должна находится в определенном физиологическом состоянии (компетентности ), которое достигается специальными методами обработки бактериальной популяции. При трансформации передаются единичные (чаще один) признаки. Трансформация является самым объективным свидетельством связи ДНК или ее фрагментов с тем или иным фенотипическим признаком, поскольку в реципиентную клетку вводится чистый препарат ДНК.
Трансдукция – это обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту с помощью умеренных (трансдуцирующих ) бактериофагов.
Трансдуцирующие фаги могут переносить один или более генов (признаков). Трансдукция бывает :
Специфической (переносится всегда один и тот же ген),
Неспецифической (передаются разные гены).
Это связано с локализацией трансдуцирующих фагов в геноме донора. В первом случае они располагаются всегда в одном месте хромосомы, во втором – их локализация непостоянна.
Конъюгация – это обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту при их прямом контакте .
После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту. Основываясь на прерывании конъюгации через определенные промежутки времени, можно определить порядок расположения генов на хромосоме бактерий – построить хромосомные карты бактерий (картирование бактерий ). Донорской функцией обладают F + клетки.
Вопрос 8. Нормальная микрофлора тела человека
1. Понятие о микробиоценозе
Нормальная микрофлора сопутствует своему хозяину на протяжении всей его жизни. О существенном ее значении в поддержании жизнедеятельности организма свидетельствуют наблюдения за животными-гнотобионтами (лишенными собственной микрофлоры), жизнь которых существенно отличается от таковой нормальных особей, а порою просто невозможна. В этой связи учение о нормальной микрофлоре человека и ее нарушениях представляет собой весьма существенный раздел медицинской микробиологии.
В настоящее время твердо установленным является положение о том, что организм человека и населяющие его микроорганизмы – это единая экосистема . С современных позиций нормальную микрофлору следует рассматривать как совокупность множества микробиоценозов , характеризующихся определенным видовым составом и занимающих тот или иной биотип в организме. В любом микробиоценозе следует различать постоянно встречающиеся виды микроорганизмов – характерные (индигенная, автохтонная флора), добавочные и случайные – транзиторные (аллохтонная флора). Количество характерных видов относительно невелико, но численно они всегда представлены наиболее обильно. Видовой состав транзиторных микроорганизмов разнообразен, но они немногочисленны.
Поверхности кожи и слизистых оболочек тела человека обильно заселены бактериями. При этом количество бактерий, населяющих покровные ткани (кожу, слизистые оболочки), во много раз превосходит число собственных клеток хозяина. Количественные колебания бактерий в биоценозе могут достигать для некоторых бактерий нескольких порядков и, тем не менее, укладываются в принятые нормативы. Сформировавшийся микробиоценоз существует как единое целое , как сообщество объединенных пищевыми цепями и связанных микроэкологией видов.
Совокупность микробных биоценозов, встречающихся в организме здоровых людей, составляет нормальную микрофлору человека. В настоящее время нормальную микрофлору рассматривают как самостоятельный экстракорпоральный орган. Он имеет характерное анатомическое строение (биопленка ) и ему присущи определенные функции. Установлено, что нормальная микрофлора обладает достаточно высокой видовой и индивидуальной специфичностью и стабильностью.